BioNTechi RNA-põhised COVID-19 süstid sisaldavad suures koguses DNA jääke. Sealhulgas SV40 promootori / võimendaja järjestus

Autorid: prof. dr. Ulrike Kämmerer, Verena Schulz ja Klaus Steger

Allikas: publichealthpolicyjournal.com 3. detsember 2024

Teema: Teadus ja meditsiin

Sissejuhatus

2020. aastal lükkasid poliitiliselt reklaamitud kampaaniad, nagu „Operation Warp Speed“ [1,2] ja „Project Lightspeed“ [3,4] täiesti uue ravimiklassi väljatöötamist, mille eesmärk oli lõpuks vaktsineerida seitse miljardit inimest kogu maailmas COVID-19 vastu [5]. Need niinimetatud “mRNA-vaktsiinid“ – edaspidi „RNA süstid või RNA bioloogilised ravimid“ – koosnevad nukleosiidiga modifitseeritud mRNA-st (modRNA), mis on pakitud transfektsioonivõimelistesse lipiidide nanoosakestesse (LNP). Põhiidee kohaselt sunnib modRNA rakus olles seda rakku tootma SARS-CoV-2 ogavalke ja esitama seda rakupinnal, mille tulemuseks on seejärel immuunsüsteemi stimuleerimine, et tekitada spetsiifilisi antikehi esitatud ogaantigeeni vastu [6,7]. “Teaduse kiirus“ [8] ja valitsuste nõudlus kogu maailmas seisid tootjate ees väljakutsega toota väga lühikese aja jooksul suures koguses modRNA-d. Seega jõudis esialgne PCR-põhine protsess DNA maatriksite (protsess-1) genereerimiseks modRNA tootmiseks, mis sai loa kasutamiseks 3. faasi kliinilises uuringus, väga kiiresti oma piirid ja ettevõtted läksid üle DNA maatriksite suuremahulisele tootmisele kloonitud süstikvektorite kaudu, mida saab bakterirakukultuurisüsteemides hõlpsasti paljundada (protsess-2) [9]. Alates valitsuse vaktsiini kasutuselevõtust kasutati seda protsessi-2 toodet algse toote asemel.

Juba 2021. aastal on teatatud, et modRNA-indutseeritud ogavalke võib leida vaktsiinide veres ringlemas nädalaid pärast süstimist [10]. 2022. aastal näitas esimene üksikasjalik surmajärgne uurimine vaktsiinist põhjustatud ogavalkude olemasolu mitmes kohas veresoonte seintes ja erinevates kudedes nädalaid pärast viimast BNT162b2 süsti [11]. Hiljuti tuvastati vaktsiinist põhjustatud ogavalgud raseduse ajal RNA bioloogilisi aineid süstinud naiste platsentas [12]. Dhuli ja kolleegid teatasid modRNA fragmendile vastava järjestuse olemasolust pika COVID-ga patsientide vererakkudes, kellel on anamneesis kaks BioNTech/Pfizeri vaktsiini annust [13]. Oluline, et ogavalkude tootmine keharakkude poolt ei piirdu süstimispiirkonnaga ega lõppenud mõne päeva jooksul, nagu tootjad ja vastutavad asutused olid kuulutanud. Seni on välja pakutud mitmeid mehhanisme, mis võiksid aidata kaasa ogavalkude märkimisväärsele pikaajalisele ekspressioonile vaktsineeritud isikutel.

Esiteks sisaldavad bioloogilised ained nukleosiidiga modifitseeritud mRNA-d (modRNA), et pikendada selle eluiga [14], vähendada selle hävitamist, lülitades välja tasulise retseptori avastamise [15], ja maksimeerida selle translatsiooni. See saavutati, asendades looduslikud uridiinid sünteetiliste N1-metüül-pseudouridiinidega (mPsi) ning suurendades guaniini ja tsütosiini sisaldust (tuntud kui koodoni optimeerimine) [6,14,16].

Teiseks võib transfekteeritud modRNA transkribeerida DNA-sse ja integreerida raku genoomi LINE1 (Long Interspersed Nuclear Element-1) vahendatud mehhanismi kaudu, nagu soovitasid inimese rakuliinide transfektsioonikatsete andmed HEK293T [17] ja Huh7 [18].

Kolmandaks võivad rakkudesse modRNA-d edastavad lipiidide nanoosakesed (LNP) sisaldada ka DNA-d, mis pärineb tootmisprotsessist, kus ogakodeerivat DNA-d kasutati modRNA in vitro transkriptsiooni mallina. Allesjäänud DNA-d ei tohi modRNA-st täielikult eraldada ja deoksüribonukleaasi-I (DNase-I) lagundamisel lagundada ning seejärel pakendada koos modRNA-ga LNP-sse. Hästi teada, et DNase-I võib kleepuda reaktsioonianumate pindadele ja võib DNA ja RNA hübriidide juuresolekul vähendada efektiivsust [19]. Tootja sõnul on „tõenäoliselt võimatu eemaldada RNA preparaadis kõiki DNA ahelaid“ [20]. Arvestades asjaolu, et Euroopa Ravimiamet ja Saksamaa Paul Ehrlichi Instituut määrasid vastuvõetavaks jääk-DNA 10 ng süstitud kliinilise annuse kohta (ja tõepoolest oli dna kuni selle piirini näidatud registreerimisdokumentides [9]), muudab see selle DNA pakendamise lipiidide nanoosakestesse väga tõenäoliseks.

See võimalus ilmnes sündmuskohal 2023. aasta veebruaris, kui McKernan ja kolleegid teatasid, et BioNTech/Pfizeri ja Moderna vaktsiinipartiides avastati suures koguses nii spike-kodeerivat DNA-d kui ka ekspressioonivektorisüsteemist saadud plasmiid-DNA-d [21,22]. Suuremat osa esindasid killustatud, lineariseeritud DNA, aga ka terved plasmiidid, mis suutsid edukalt transfekteerida E. coli rakke [21,22]. Eeldades, et need puutumatud plasmiidid olid pakitud LNP-sse koos modRNA-ga, võivad stabiilsed ekspressioonivektorid rakkudesse siseneda ja seega pakkuda rikkalikku allikat pikaajaliseks piigitootmiseks juhul, kui rakud on võimelised kodeeritud piigipiirkonda transkribeerima. Arusaamatul kombel ei sisalda BioNTech/Pfizeri, kuid mitte Moderna plasmiidid mitte ainult bakteriaalset T7 promootorisüsteemi, vaid ka imetajate Simian Virus 40 (SV40) promootori/võimendaja järjestust [23-25]. See annab põhjust muretsemiseks, sest juba 1999. aastal näitasid Dean ja kolleegid, et plasmiidi-DNA tuumasisenemine, eriti mittejagunevates rakkudes, nõuab SV40 promootori/võimendaja 72 bp järjestust [23]. Tähelepanuväärne, et plasmiidi-DNA tuuma lokaliseerimiseks ei ole vaja promootorit ega replikatsiooni päritolu [23]. Vahepeal on McKernani meeskonna tulemused kinnitatud ja pikendatud [26]. Hiljuti avaldasid Köning ja Kirchner andmed suurte DNA jääkide koguste kohta mitmes BNT162b2 partiis [27].

Selle taustal viisime läbi rea katseid, et vastata järgmistele kiireloomulistele küsimustele. Esiteks, kas BioNTechi partiides [27] ja isegi Pfizeri partiides tuvastatud plasmiidide [21,22] suurt hulka jääk-DNA-d saab kinnitada BioNTechi ainult partiidel (BNT162b2, Comirnaty), mida levitatakse Saksamaal erinevate võrreldavate DNA tuvastamise meetoditega? Teiseks, kas jääkplasmiide või DNA fragmente, kui need on olemas, saab tõhusalt transfekteerida inimese rakkudesse koos kodeeriva modRNA-ga? Kolmandaks, kas need bioloogilised ained võivad indutseerida ogavalgu jätkuvat rakulist ekspressiooni, luues seeläbi pikaajalised immuunrünnaku fookused? Nendele küsimustele vastamiseks rakendasime in vitro rakukultuuri mudelit, kasutades HEK293 rakke, kuna need rakud simuleerivad jagavaid inimrakke ja on seetõttu mitte ainult sobiv sihtmärk valgu tootmiseks, vaid on ka kõige vastuvõtlikumad transfekteeritud võõraste nukleiinhapete ja raku genoomi potentsiaalsele interaktsioonile. Asjaolu, et saime positiivseid tulemusi kõigis küsimustes, tekitab kõige suuremat muret BNT162b2 vaktsiini ohutuse pärast.

Aruande lugemiseks klõpsake siin.

Selle artikli algne allikas on publichealthpolicyjournal.com, 2024

Autorid: prof. dr. Ulrike Kämmerer, Verena Schulz ja Klaus Steger 

Viited

1. Winch, G.M., Cao, D., Maytorena-Sanchez, E., Pinto, J., Sergeeva, N., Zhang, S. Operation Warp Speed: Projects responding to the COVID-19 pandemic. Project Leadership and Society. 2:100019. 2021. https://doi.org/10.1016/j.plas.2021.100019
2. Operation Warp Speed. 2021. Available online: https://www.gao.gov/products/gao-21-319 (juurdepääs on 25.06.2024)
3. Türeci, Ö., Sahin, U. Projekt Lightspeed (German). 2021. ISBN10 3498002775.
4. Project Lightspeed. 2020. Saadaval Internetis: https://www.pei.de/SharedDocs/Downloads/EN/newsroom-en/dossiers/ppt-erste-studie-sars-cov-2-impfstoff-en.pdf?__blob=publicationFile&v=2 (juurdepääs on 25.06.2024)
5. France24. 2020. Saadaval Internetis: https://www.pfizer.com/science/innovation/mrna-technology (juurdepääs on 25.06.2024)
6. Webpage BioNTech. https://www.biontech.com/int/en/home/pipeline-and-products/platforms/our-mrna-platforms.html
7. Webpage Pfizer. https://www.pfizer.com/science/innovation/mrna-technology
8. Shot of a lifetime. Saadaval Internetis: https://www.pfizer.com/news/articles/shot_of_a_lifetime_how_pfizer_and_biontech_developed_and_manufactured_a_covid_19_vaccine_in_record_time (juurdepääs on 24.06.2024)
9. EMA Assessment Report. 2021. Saadaval Internetis: https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/comirnaty-epar-public-assessment-report_en.pdf (juurdepääs on 25.06.2024)
10. Bansal, S., Perincheri, S., Fleming, T., Poulson, C., Tiffany, B., Bremner, R.M., Mohanakumar, T. Cutting Edge: Circulating exosomes with COVID spike protein are induced by BNT162b2 (Pfizer-BioNTech) vaccination prior to development of antibodies: A novel mechanism for immune activation by mRNA vaccines. Journal of Immunology. 207:2405-2410. 2021. https://doi.org/10.4049/jimmunol.2100637
11. Mörz, M. A Case Report: Multifocal Necrotizing Encephalitis and Myocarditis after BNT162b2 mRNA Vaccination against COVID-19. Vaccines. 10:1651. 2022. https://doi.org/10.3390/vaccines10101651
12. Hanna, N., Lin, X., Thomas, K., Vintzileos, A., Chavez, M., Palaia, T., Ragolia, L., Verma, S., Khullar, P., Hanna, I. Underestimation of SARS-CoV-2 infection in placental samples. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 225:572-575.e1. 2021. https://doi.org/10.1016/j.ajog.2021.07.010
13. Dhuli, K., Medori, M.C., Micheletti, C., Donato, K., Fioretti, F., Calzoni, A., Praderio, A., De Angelis, M.G., Arabia, G., Cristoni, S., Nodari, S., Bertelli, M. Presence of viral spike protein and vaccinal spike protein in the blood serum of patients with long-COVID syndrome. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 27 (Suppl. 6):13-19. 2023. https://doi.org/10.26355/eurrev_202312_34685
14. Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö. mRNA-based therapeutics–developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13:759-780. 2014. https://doi.org/10.1038/nrd4278
15. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23:165-175. 2005. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2005.06.008
16. Granados-Riveron, J.T., Aquino-Jarquin, G. Engineering of the current nucleoside-modified mRNA-LNP vaccines against SARS-CoV-2. Biomedicine and Pharmacotherapy. 142. 2021. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2021.111953
17. Zhang, L., Richards, A., Barrasa, M.I., Jaenisch, R. Reverse-transcribed SARS-CoV-2 RNA can integrate into the genome of cultured human cells and can be expressed in patient-derived tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118:e2105968118. 2021. https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118
18. Alden, M., Olofsson Falla, F., Yang, D., Barghouth, M., Luan, C., Rasmussen, M., De Marinis, Y. Intra-cellular reverse transcription of Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA vaccine BNT162b2 in vitro in human liver cell line. Current Issues in Molecular Biology. 44:1115-1126. 2022. https://doi.org/10.3390/cimb44030073
19. Sutton, D.H., Conn, G.L., Brown, T., Lane, A.N. The dependence of DNase I activity on the conformation of oligodeoxynucleotides. Biochemical Journal. 321:481-486. 1997. https://doi.org/10.1042/bj3210481
20. Webpage Thermofisher. https://www.thermofisher.com/de/de/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/dnase-i-demystified.html
21. McKernan, K. Pfizer and Moderna bivalent vaccines contain 20-35% expression vector and are transformation competent in E. coli. 2023. https://anandamide.substack.com/p/pfizer-and-moderna-bivalent-vaccines
22. McKernan, K., Helbert, Y., Kane, L.T., McLaughlin, S. Sequencing of bivalent Moderna and Pfizer mRNA vaccines reveals nanogram to microgram quantities of expression vector dsDNA per dose. OSF Preprints. 2023. https://doi.org/10.31219/osf.io/b9t7m
23. Dean, D.A., Dean, B.S., Muller, S., Smith, L.C. Sequence requirements for plasmid nuclear import. Experimental Cell Research. 253713-22. 1999. https://doi.org/10.1006/excr.1999.4716
24. Sequencing the Pfizer monovalent mRNA vaccines also reveals dual copy 72-bp SV40 Promoter. 2023. https://anandamide.substack.com/p/sequencing-the-pfizer-monovalent
25. Vaccine targeted qPCR of Cancer Cell Lines treated with BNT162b2. 2024. https://anandamide.substack.com/p/vaccine-targeted-qpcr-of-cancer-cell
26. Speicher, D.J., Rose, J., Gutschi, L.M., Wiseman, D.M., McKernan, K. DNA fragments detected in monovalent and bivalent Pfizer/BioNTech and Moderna modRNA COVID-19 vaccines from Ontario, Canada: Exploratory dose response relationship with serious adverse events. OSF Preprints. 2023 https://doi.org/10.31219/osf.io/mjc97
27. König, B., Kirchner, J.O. Methodological considerations regarding the quantification of DNA impurities in the COVID-19 mRNA vaccine Comirnaty. Methods and Protocols. 7:41. 2024. https://doi.org/10.3390/mps7030041