Jon Fleetwoodi poolt

NIH rahastatud projekt kirjeldab, kuidas täielikke koroonaviiruse genoome saab digitaalselt kokku panna, redigeerida ja rekonstrueerida, eemaldades lõplikust järjestusest nähtavad geneetilise manipuleerimise jäljed.

2002. aasta novembris – samal kuul, mil Hiina võimude hilisemate avalduste kohaselt ilmnesid Guangdongi provintsis esimesed SARSi juhtumid – avaldas Põhja-Carolina ülikooli koroonaviiruse viroloogi Ralph Barici juhitud meeskond artikli, milles kirjeldati programmeeritavat süsteemi täispikkade koroonaviiruse genoomide kokkupanekuks, mis on võimeline rekonstrueerima koroonaviiruse genoome, eemaldades samal ajal lõplikust konstruktsioonist nähtavad kokkupanekujäljed.

Artikkel, mis avaldati 1. novembril 2002 ajakirjas Journal of Virology, kandis pealkirja „Hiire hepatiitviiruse tüve A59 täispika nakkava cDNA süstemaatiline kokkupanek“ ja kirjeldas uut pöördgeneetika platvormi täieliku koroonaviiruse genoomi kokkupanekuks modulaarsetest DNA fragmentidest.

Tööd rahastasid Ameerika maksumaksjad riiklike tervishoiuinstituutide (NIH) uurimistoetuste näol: „AI23946 ja GM63228 RSB-le, AI26603 MRD-le ja AI17418 SRW-le”.

Juba enne SARS-CoV-1 puhangu esmakordset teatamist oli Barici 2002. aasta töö loonud programmeeritava platvormi koronaviiruste pöördgeneetika jaoks, mis suutis genoomi modulaarselt kokku panna, luua sujuvaid ja armivabasid rekonstruktsioone, teostada sihipäraseid geneetilisi manipulatsioone ja väidetavalt saada kunstlikult toodetud geneetilistest järjestustest nakkavat koroonaviiruse materjali.

Need süsteemid võimaldasid teadlastel laboritingimustes kiiresti ja laiaulatuslikult koronaviiruseid kujundada, modifitseerida, rekonstrueerida, testida, sekveneerida ja uurida – need võimed seostusid hiljem üha enam diagnostika, vaktsiinide väljatöötamise, genoomse seire, pandeemiatõrje uuringute ja laiema koroonaviiruseks valmisoleku infrastruktuuriga.

Ajaline seos tekitab ilmseid küsimusi selle kohta, kas ülimalt keerukate, riiklikult rahastatud koroonaviiruse insenerisüsteemide teke ja SARSi ajastu algus olid tõeliselt sõltumatud sündmused.

Uuring keskendus hiire hepatiidiviirusele (MHV), mis on II rühma koroonaviirus, kuid publikatsioonis kirjeldati avalikult paindlikku süsteemi täispikkade koroonaviiruse genoomide konstrueerimiseks ja rekonstrueerimiseks.

„Töötati välja uudne meetod hiire hepatiidiviiruse tüve A59, mis on II rühma koroonaviirus, täispika nakkusliku cDNA kokkupanekuks,“ seisab väljaandes.

Teadlased selgitasid, et nad jagasid koroonaviiruse genoomi seitsmeks eraldi cDNA fragmendiks, konstrueerisid fragmentide otstesse unikaalsed ühendused ja seejärel panid kogu genoomi uuesti kokku täispikkuseks konstruktsiooniks.

„Iga cDNA otstes asuvad ühendavad restriktsioonisaidid eemaldatakse täispika cDNA produkti kokkupaneku ajal süstemaatiliselt, võimaldades uuesti kokkupanekut ilma nukleotiidmuudatusteta,“ seisab publikatsioonis.

See tähendab, et ehituse ajal kasutatud kunstlikud montaažimarkerid ei jäänud lõplikus rekonstrueeritud genoomis nähtavaks.

Artiklis kirjeldati seda kui „No See’m” tehnoloogiat: armideta kokkupanekumeetodit, mis on loodud metsiktüüpi viiruse täpse järjestuse taastamiseks ühenduskohtades pärast kokkupanekut.

Autorid selgitasid süsteemi järgmiselt:

“Pärast lõhustamist ja külgneva fragmendiga ligeerimist kaovad lõpptootes mõlemad Esp3I liidesed, nii et täpne MHV-A59 järjestus jääb ühenduspunkti.”

Uuring jätkub järgmiselt:

“Kokkupandud tootel ei tohiks olla jälgi Esp3I liidesest, mis oli üksikutesse kloonidesse sisse ehitatud.”

Väljaanne rõhutas ka, et platvorm võimaldab kogu koroonaviiruse genoomi sihipärast manipuleerimist.

„MHV-A59 täispikad nakkuskonstruktid võimaldavad kogu koroonaviiruse genoomi geneetilisi modifikatsioone,“ kirjutasid autorid.

Teadlased selgitasid ka, et meetodil on rakendusi ka väljaspool koroonaviirustega tegelemist:

“Meetodil on potentsiaali kasutada viiruslike, mikroobsete või eukarüootsete genoomide konstrueerimiseks, mille pikkus on mitu miljonit aluspaari, ja restriktsioonisaitide sisestamiseks mis tahes nukleotiididesse mikroobses genoomis.”

Avaldamise ajastus on oluline, kuna teos ilmus täpselt samal ajaloolisel hetkel, mil maailm sisenes tänapäevaste koroonaviiruse puhangute ajastusse.

Praktikas kirjeldas töö süsteemi, mis võimaldas teadlastel arvutis ja laboris koronaviirusi konstrueerida ja modifitseerida, luua kiiresti testitavaid viirusmudeleid ning uurida, kuidas teatud geneetilised muutused viirust mõjutasid.

Need oskused olid olulised PCR-testide väljatöötamiseks, vaktsiiniuuringuteks, viiruste jälgimiseks ja ulatuslike pandeemiatõrjeprogrammide jaoks pärast SARSi teket.

Käsikiri saabus ajakirja algselt 31. jaanuaril 2002, see võeti vastu 22. juulil 2002 ja avaldati lõpuks ajakirja Journal of Virology 2002. aasta novembrinumbris.

Hiljem samal kuul teatasid Hiina võimud, et Guangdongi provintsis on tuvastatud esimesed SARS-CoV-1 juhtumid – see puhang kiirendab järgmise kahe aastakümne jooksul dramaatiliselt ülemaailmseid investeeringuid koroonaviiruse sekveneerimisse, pöördgeneetikasse, PCR-diagnostikasse, genoomsesse seiresse, sünteetilisse bioloogiasse, vaktsiiniplatvormidesse ja pandeemia-uuringute taristusse.

Aastaid hiljem visandas ja patenteeris Baric, kuidas konstrueerida koroonaviirusi SARS-CoV-2 iseloomulike tunnustega – furiini lõhustumiskoha (PRRA) sisestamine S1/S2 ühenduskohta, sihipärased, inimesele optimeeritud mutatsioonid kogu retseptori sidumispiirkonnas (sealhulgas kriitiline jääk Q498) ja asendamine kahe proliiniga (V1060P/L1061P), et stabiliseerida ogavalku selle prefusiooni konformatsioonis – vaid paar kuud enne COVID-19 pandeemia algust.