Avaldus nr 234.6568 (testimine, karantiin- ja isolatsioon) 28.10.2024. Lk 1-36 1.osa

Lugupeetud Õiguskantsler, Terviseamet ja Sotsiaalministeerium 28.10.2024

nr 234.6568

Õiguskantsleri Kantselei kontaktid

Kohtu 8, 15193 Tallinn

Tel: (+372) 693 8404

E-post: [email protected]

Sotsiaalministeeriumi kontaktid

Suur-Ameerika 1, 10122 Tallinn

Tel (+372) 626 9301

E-post: [email protected]

Terviseameti kontaktid

Paldiski mnt 81, 10614 Tallinn

Tel: (+372) 794 3500

E-post: [email protected]

Avalduse esitaja kontaktid

Tel: (+372) 538 24 760

E-post: [email protected]

Asi: Eesti riigis kehtestatud tuhanded koroonakarantiinid oli ”ebaseaduslik vabaduse võtmine”

Eelkõige peaks õiguskantsler „jura novit curia“ põhimõttest lähtuvalt õigust juba tundma ning ei ole põhjust kutsuda täiendavaid õiguseksperte oma arvamust esitama õiguses, mida õiguskantsler juba tunneb. Õiguskantsleri nõustajate hulgas ei ole siiski avaldajale teadaolevalt rahvusvahelise õiguse erijuriste, kellel on eriteadmised rahvusvahelise õiguse valdkonnas, mis on otseselt seotud rahvusvahelise (a) hädaolukordade õigusega ja (b) meditsiiniõigusega. Seda asjaolu arvestades esitab avaldaja käesolevas asjas tavaõiguse rikkumiste alused.

Faktilistest asjaoludest nähtub, et Eesti riigil puudus rahvusvahelise õiguse ja välislepingute alusel alus kehtestada (i) COVID-19 nakkusohutustõendi (koroonapass) (pool)sund ning määrata karantiine, kuna need administratiivsed poliitilised meetmed on kumulatiivses seoses hädaolukorra väljakuulutamisega 12. märtsil 2020. aastal Eesti Vabariigi peaministri „post facto“ hädaolukorra määrusega, väitega, et „tasandada SARS-CoV-2 viiruse leviku kõverat kaks nädalat“.

Vabariigi Valitsuse liikmete ja olukorra eest vastutavate ametnike isikute vastu esitatud avaldust toetab koroonapassi ja karantiini määramise asjas sõltumatu ekspertiis ja välisriikide kohtute kohtuotsused.

Õiguskantsler ja Terviseamet ei ole vaidlustanud või viinud läbi täiendavat siseriikliku ekspertiisi ning seega on nõustunud 30.08.2024. aastal avaldaja asjas nr 2345.658 esitatud faktiliste asjaoludega ja õiguslike järeldustega. Samuti ei ole Õiguskantsler ja Terviseamet pidanud asjakohaseks vaidlustada välisriikide kohtuotsustega õigeks võetud aruandeid ja nende alusel tehtud kohtute järeldusi. Arvestades eelolevaga esitatakse alljärgnevalt avaldaja väidete kinnitamiseks täiendav aruanne, et tõendada faktiliselt ja õiguslikult tekitatud kahju avaldajale ja teistele tsiviilühiskonna liikmetele.

Sisukord

1.1. Mõistete/põhitõdede selgitus 3

1.2. Põhiteave diagnostilise tähtsuse kohta 5

1.3. PCR-testi usaldusväärsust mõjutavad tegurid 5

1.3.1. Sõltumatute sihtgeenide arv (“sihtmärgid”) 5

1.3.2. Läbiviidud tsüklite arv (CT väärtus) 6

1.3.3. Piisav kontroll 9

1.3.4. Reaktiivide saastumise ja „probleemide kõrvaldamine tegevuse käigus“ 10

1.3.5. Kaubanduslikud PCR-testikomplektid: diagnostika heakskiit? 11

1.4. RT-qPCR positiivse nukleiinhappe tuvastamise ja nakkavuse vaheline seos 12

1.5. Järeldus: RT-qPCR testide tähendus koroonaviiruse SARS-CoV-2 nakkuse tuvastamiseks 13

Antigeeni tuvastamine kiirtesti abil 13

2.3. Antigeeni kiirtestide usaldusväärsust mõjutavad tegurid 15

2.3.1. Eeltesti tõenäosus 15

2.3.2. Tundlikkus (tundlik) 15

Kirjandus 18

Segregatsioon testi alusel: PCR-testiga seotud sunnimeetmete kasutuselevõtt 19

III. Avaldus Õiguskantslerile, Sotsiaalministeeriumile ja Terviseametile 27

Lühendid 31

Allikad ja viited 32

Prof dr. rer. biol. hum. Ulrike Kämmerer

Prof dr. rer. biol. hum. Ulrike Kämmerer [] esindab Würzburgi ülikooli haigla naistekliinikut, eelkõige inimbioloogia, immunoloogia ja rakubioloogia valdkondades. Ekspert esitas oma molekulaarbioloogia ekspertiisiaruande, mis on siin täielikult lisatud, järgmiselt:

Küsimusele tõendite kohta: „Millist tähtsust annavad RT-qPCR-test ja praegu kasutatavad kiirtestid SARS-CoV-2 koroonaviirusega nakatumise tuvastamiseks?“

1. Nukleiinhapete tuvastamine RT-qPCR testi abil

Pöördtranskriptaasi kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni (Reverse-Transkriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction, RT – qPCR) testid ei sobi SARS-CoV-2 aktiivse infektsiooni diagnostiliseks vahendiks mitmel põhjusel.

1.1. Mõistete/põhitõdede selgitus

Polümeraasi ahelreaktsioonis (PCR) amplifitseeritakse ensüümi polümeraasi abil määratletud lühike tükk (tavaliselt 100–1000 alust) desoksüribonukleiinhapet (DNA). Replitseeritav DNA tükk kitseneb, kasutades kahte väga lühikest üheahelalist DNA osa, mida nimetatakse „praimeriteks“.

Need praimerid koosnevad tavaliselt 18–25 nukleiinhappealusest koosnevast defineeritud järjestusest (praimeri järjestus), olles vastavuses spetsiifiliselt DNA piirkondadega, mis külgnevad replitseeritava lõiguga. PCR-i spetsiifilisuse tagamiseks peavad need praimerid selgelt sobima ainult selle külgneva piirkonnaga ja mitte ühegi teise DNA piirkonnaga. Suurte geeniandmebaaside ja sobivate tarkvaraprogrammide [1] abil saab nii neid praimereid kujundada, et need oleksid PCR-i kujundamisel väga spetsiifilised. Spetsialiseerunud ettevõtetes sünteesitakse seejärel esitatud praimeri järjestustest molekulaarsed ahelad ja toimetatakse PCR-laborisse või PCR-komplektide tootjale. Siin tuleb neid praimereid seejärel testida kehtivate positiivsete ja negatiivsete kontrollidega paljudes katsetingimustes ja optimeerida nende kasutamist. See tagab, et kasutatav praimeripaar tunneb ära ja kordab ainult otsitava DNA, kuid mitte ühtegi muud sarnast DNA lõiku.

Kui praimerid on leitud ja spetsiifilised, võib amplifitseeritava DNA segada praimeripaari, erinevate abikemikaalide ja ensüümi polümeraasiga reaktsioonisegus ning alustada ahelreaktsiooni.

PCR protsess: see toimub järgmiste üksikute etappide tsükliliste kordustena:

Segu keedetakse (denatureeritakse) temperatuuril üle 90°C. Selle tulemusena eraldatakse DNA ahelad, mis esinevad tavaliselt kaheahelalistena, üksikuteks ahelateks, et võimaldada praimerite hilisemat kinnitamist.
Järgneva jahutamise ajal nn anniilimistemperatuurini saavad praimerid kinnituda eraldatud DNA ahelate sobivate piirkondade külge. Praimerite sidumine, lõõmutamine, toimub ainult kitsas temperatuurivahemikus, nn sulamistemperatuuril. See sõltub eelkõige praimerite põhikoostisest ja seetõttu valitakse nende järjestus ideaaljuhul alati selliselt, et mõlemal praimeril oleks sama sulamistemperatuur ca 60°C. Kinnitatud praimerid moodustavad polümeraasi lähtepunkti.
Alustades praimeritest, täiendab see polümeraas üheahelalist DNA-d, mis on olemas kuumutamise tulemusena, moodustades sobiva kaheahelalise ahela (pikenemine), tavaliselt umbes 72 °C juures.

Kahe praimeri asukoha tõttu otsitava DNA lõigu külgnevatel külgedel on üksikute ahelate pikenemisreaktsioonid vastupidises suunas, kuna polümeraas töötab ainult ühes suunas. Selle etapi lõpus on algsest kaheahelalisest DNA-st nüüdseks saanud kaks identset kaheahelalist DNA molekuli, mis eraldatakse uuesti keetmise teel, seejärel korrutatakse neljaks identseks DNA molekuliks, kasutades praimeri anniilimist ja polümeraasi jne.

Iga PCR tsükkel koosneb keetmine-anniilimine-pikenemine, põhjustab otsitava DNA lõigu kahekordistumise, nii et dubleerimine toimub logaritmis 2 ja seega saadakse väga kiiresti väga suur hulk algse lähtematerjali koopiaid. Pärast 10 PCR tsüklit saab DNA ahelast 210 = 1024 DNA koopiat, 20 tsükliga üle 1 miljoni (1 048 576) ja 30 tsükliga üle 1 miljardi (1 073 741 824) koopia.

Kvantitatiivne PCR (qPCR) tehnika, mida praegu maailmas kasutatakse peamiselt SARS-CoV-2 genoomse RNA tuvastamiseks, kasutab kolmandat lühikest DNA tükki, mis on sarnane kahe praimeriga, seondudes sobivalt DNA sektsiooni keskel. Otsida saab „proovi“ (sond). Erinevalt kahest praimerist on see sond ühendatud kahe molekuliga, mille ühes otsas on fluorestseeruv värvaine ja teine molekul (kustutaja), mis võib takistada fluorestsentsi emissiooni seni, kuni mõlemad on proovil korraga (st vahetus läheduses üksteisele).

Pikendusetapi ajal lõhustab polümeraas selle sondi. See eraldab kustutaja ja fluorestseeruv molekul saab nüüd oma värvisignaali väljastada. See värvisignaal salvestatakse ja mõõdetakse PCR-i teostavas seadmes (termocycler). Iga PCR-tsükliga vabaneb üha rohkem fluorestsentssignaale sõltuvalt koopiate suurenemisest ja sond “süttib“ üha eredamalt. Ja värvisignaali intensiivsuse kõver suureneb iga tsükliga. Teatud väärtusest alates ületab kõver taustmüra (läve) ja loetakse positiivseks. Tsüklite arvu, mille juures läviväärtus on ületatud, nimetatakse CT väärtuseks (CT tähistab „Cycle Threshold“).

Mida kiiremini fluorestsents suureneb (madalam CT), seda rohkem oli PCR-meetodil otsitava DNA esialgseid koopiaid. Kuna ei praimerid ega ensüümi polümeraas ei tööta alati 100% spetsiifiliselt, kopeeritakse igas PCR-meetodis ka osa mittespetsiifilisest DNA-st. Ja mida rohkem tsükleid PCR läbib, seda suurem on oht, et isegi need vähesed ebaspetsiifilised reaktsioonid ületavad läviväärtust.

Alates CT väärtusest 40 on kõige tõenäolisem, et valepositiivne signaal on tingitud mittespetsiifilistest lähteainetest. Usaldusväärne PCR ei tohiks seetõttu nõuda rohkem kui 30–35 tsüklit, et tekitada selge „positiivne“ signaal, kui otsitakse viirustega nakatumist, võib eeldada, et tsüklite arv on piisav 25–30 (vt ka punkt 3.2);.

Pöördtranskriptaasi reaktsioon (RT) on vajalik, kui replitseeritav lähtenukleiinhape ei esine DNA-na, vaid ribonukleiinhappena (RNA), nagu see on SARS-CoV-2 kui RNA-viiruse puhul. Kuna PCR-is saab amplifitseerida ainult DNA-d, tuleb RNA esmalt DNA-ks muuta. Seda tehakse ensüümi „pöördtranskriptaasi“ abil, mis loob RNA-st DNA komplementaarse koopiaahela, olles seejärel PCR lähteaine. RT-qPCR või lihtsalt PCR abil saadud tulemuse usaldusväärsuse hindamiseks hinnatakse kasutatud testimissüsteemi tundlikkust ja spetsiifilisust.

Tundlikkus näitab, kui tundlikult suudab test tuvastada otsitava sihtgeeni väikseimaidki koguseid. Spetsiifilisus kirjeldab, kui usaldusväärselt välistab test võimaluse, et ka teised, omavahel lähedalt seotud geenid annavad positiivse tulemuse (valepositiivne). Mida kõrgem on spetsiifilisus, seda kindlam, et PCR-süsteem ise ei anna valepositiivseid tulemusi.

See aga ei mõjuta valepositiivseid sündmusi, mis võivad tekkida laboratoorsest saastumisest sihtgeenidega, uuritavate kemikaalide saastumisest ja saastumisest vahetult proovi kogumise ajal. Neid saastumisega seotud valepositiivseid tulemusi saab kõrvaldada range kvaliteedi tagamise ja standardsete tööprotseduuride (SOP) abil, kasutades selleks spetsiaalselt koolitatud spetsialisti ja pidevat välist kontrolli ringtestide vormis.

1.2. Põhiteave diagnostilise tähtsuse kohta

PCR-testi leiutaja, Nobeli preemia laureaat Kary Mullis, kes suri 2019. aasta augustis, korduvalt juhib tähelepanu, et ainuüksi tema test sobib inimesele muidu nähtamatu molekuli (desoksüribonukleiinhape, DNA) või DNA fragmendi tuvastamiseks, silmale (võimendus) nähtavaks tegema. Aga mitte lubada avaldust teha, kas nähtavaks tehtu on ohtlik või teeb haigeks.

Eelkõige ei saa PCR-test, isegi kui see on õigesti tehtud, anda teavet selle kohta, kas inimene on nakatunud aktiivse patogeeniga või mitte. Selle põhjuseks on asjaolu, et test ei suuda teha vahet “surnud“ ainetel*, nagu täiesti kahjutu genoomi fragment, mis on jäänuk organismi immuunsüsteemi võitlusest külmetuse või gripi vastu (selliseid genoomi fragmente võib leida veel mitu kuud pärast immuunsüsteemi taastumist), “elus“ aine, st “värske“ reprodutseeritav viirus.

Näiteks kasutatakse PCR-i ka kohtuekspertiisis, et amplifitseerida jääk-DNA karvajääkidest või muudest jälgmaterjalidest, kasutades PCR-i nii, et on võimalik tuvastada kurjategija(te) geneetiline päritolu (“geneetiline sõrmejälg”).

Isegi kui PCR läbiviimisel on kõik tehtud “õigesti”, sealhulgas kõik ettevalmistavad etapid (PCR kavandamine ja loomine, proovide kogumine, ettevalmistamine ja PCR läbiviimine) ja test on positiivne, st genoomi järjestus tunneb ära, mis on olemas, kui see on olemas, üks või isegi spetsiifiline koroonaviirus (SARS-CoV-2), ei tähenda see mingil juhul, et isik, kelle test oli positiivne, oleks nakatunud replitseeruvasse SARS-CoV-2 ja seetõttu teistele inimestele nakkav = võib olla ohtlik.

Pigem tuleb SARS-CoV-2 aktiivse infektsiooni kindlakstegemiseks kasutada täiendavaid spetsiifilisi diagnostilisi meetodeid, nagu reprodutseeritavate viiruste eraldamine (kuldstandard).

1.3. PCR-testi usaldusväärsust mõjutavad tegurid

Tegelikult sõltuvad PCR-testi tulemused mitmest parameetrist, mis ühelt poolt põhjustavad märkimisväärset ebakindlust ja teisest küljest on nendega konkreetselt selliselt manipuleeritavad, et paljud või vähesed (ilmselt) positiivsed tulemused annavad “tulemuse“.

1.3.1. Sõltumatute sihtgeenide arv (“sihtmärgid”)

WHO poolt 13. jaanuaril 2020 algselt avaldatud protokollis „Diagnostic detection of Wuhan coronavirus 2019 by real-time PCR“ („Wuhani koroonaviiruse 2019 diagnostiline tuvastamine reaalajas PCR abil”) [2] kirjeldab viiruse kolme sõltumatu osalise geeni PCR tuvastamise järjestust, mis hiljem nimetati ümber SARS-CoV-2. Järjekord viitas E geenile, RdRp geenile ja seejärel N geenile. WHO tegi 17. jaanuaril 2020 muudatuse protokolliga „Diagnostic detection of 2019-nCoV by real time PCR“ („2019-nCoV diagnostiline tuvastamine reaalajas PCR-iga“) [3], milles N-geen eemaldati tõendina ja seetõttu soovitati algse 3 sihtmärgi asemel ainult 2 sihtmärki. 2. märtsil 2020 uuendas WHO testimisprotokolli „Laboratory testing for coronaviurs disease 2019 (COVID-19) in suspected human cases“ („Koroonaviirushaiguse 2019 (COVID-19) laboratoorsed testid kahtlustatavatel inimjuhtumitel”), [4] tõi välja:

„[…] In areas where COVID-19 virus is widely spread a simpler algorithm might be adopted in which for example screening by RT-PCR of a single discriminatory target is considered sufficient. […]”

„[…] Piirkondades, kus COVID-19 viirus on laialt levinud, võib kasutusele võtta lihtsama algoritmi, milles näiteks sõeluuringud ühe diskrimineeriva sihtmärgi RT-PCR loetakse piisavaks […]” (lk 3 allpool),

mispeale läksid laborid üle vaid ühe sihtmärgi laiaulatuslikule analüüsimisele, seejärel keskendusid paljud laborid vaid esimesena kasutusele võetud sihtmärgile. E-Gen kui kehtiv PCR spetsialiseerunud, näiteks selgesõnaliselt Augsburgi laborist 3. aprillil kirjeldatud [5].

PCR-iga analüüsitud sõltumatute sihtgeenide arvu silmapaistvat tähtsust saab näha järgmisest arvutusest

Algselt WHO protokollis SARS-CoV-2 tuvastamiseks määratud kolme sihtmärki E, RdRp ja N-Gen kasutati kiiresti paljudes laboratoorsetes ja kaubanduslikes katsesüsteemides. Institut Instand eV ringtest [6] näitas nende puhul keskmist spetsiifilisust geenid päritolu kohta:

SARS-CoV-2 genoomi sihtgeen	Kontrollitud testide arv	Spetsiifilisus ainult rakukultuuris (ilma viiruse RNA-ta)	Spetsiifilisus seotud koroonaviirusega (HCoV 229E)	%	Keskmise spetsiifilisusega absoluutne	Keskmine veamäär (1-abs. spetsifikatsioon)
E-Gen	24	99,46%	95,17%	97,31	0,9731	0,0269
RdRp geen	13	97,80%	90,66%	94,23	0,9423	0,0577
N geen	21	98,20%	87,95%	93.08	0,9308	0,0692

100 000 testist koosnevas segapopulatsioonis, isegi kui pole tõeliselt nakatunud inimest, oleks keskmine veamäär järgmine:

Puhta E-geeni testi jaoks: 100 000 x 0,0269 = 2690 vale

Järjestikuse E- ja RdRp-testi positiivne: 100 000 x (0,0269 x 0,0577) = 155

Valepositiivsed kõigi kolme geeni (E, RdRp, N) puhul: 100 000 x (0,0269 x 0,0577 x 0,0692) = 10 valepositiivset

See tähendab, et WHO nõue vähendada järk-järgult testitavate SARS-CoV-2 sihtgeenide arvu kolmelt ühele tõi kaasa valepositiivsete inimeste arvu suurenemise ülaltoodud arvutusnäites 10-lt 3 geeni puhul peaaegu 3000 ainult ega E-geeni 100 000 tehtud testi kohta. Kui läbiviidud 100 000 testi esindaksid 7 päeva jooksul 100 000 linna/piirkonna kodanikku, oleks see üksi kasutatud sihtgeenide küsimus 155 võrreldes 2690-ga erinevuse esinemissagedus “päevas“ ja sellest olenevalt kodanike vabadusele seatud piirangute raskusaste.

Hindamine: arvutusnäide näitab ka seda, kuidas igapäevaste juhtumite numbreid saab manipuleerida, “mängides spetsifikatsioonidega“ seoses laborite jaoks tuvastatavate sihtmärkidega. Arvestades tohutut mõju poliitilistele otsustele, mille määravad positiivsete testide absoluutarvud ja nendest tuletatud „7-päevane esinemissagedus”, oli WHO (ja ka RKI) nõue sihtgeenide vähendamiseks selgelt sobilik, lõpetades valede testispetsifikatsioonide tõttu kunstlikult 300 korda ülespuhutud pandeemia.

See on tõenditevaba lähenemine, mis ühelt poolt toob endaga kaasa tohutud isiklikud piirangud karantiinile/isolatsioonile, mida valepositiivse testiga inimesed peavad taluma, teisalt ka 7-päevase haigestumuse arvu, mis toob kaasa tohutuid sotsiaalseid ja majanduslikke piiranguid ning kahju aktsepteeritakse meelsasti. Kui PCR analüüsiks oleks järjekindlalt kasutatud õiget sihtarvu kolme või isegi paremat (nagu näiteks Tais) kuni 6 geeni, oleks positiivsete testide määr ja seega ka „7-päevane esinemissagedus“ peaaegu vähenenud täiesti nulli.

1.3.2. Läbiviidud tsüklite arv (CT väärtus)

Lisaks tuvastatud sihtgeenide arvule, eriti ainult ühe või maksimaalselt kahe geeni puhul, qPCR-i amplifikatsioonitsüklite arv on kuni “positiivse“ hinnanguni ja sellest tulenev CT väärtus oluline reguleerimiskruvi. Mida suurem on proovi CT väärtus qPCR-is, seda suurem oli DNA esialgne kogus proovis. Standardsetes tingimustes korreleerub see (viiruste puhul) viiruste algse kogusega, nn viiruskoormusega, mis ideaaljuhul tuleks täpsustada kui “viiruse koopiate arv“ proovi kohta. SARS-CoV-2 puhul korreleerub see viiruskoormus ka võimega kasvatada nakkavaid viirusi rakukultuuris, nagu avaldati juba 2020. aasta märtsis Drosteni osalusel [7]. Siin oli vajalik minimaalne kogus 106 RNA koopiat/ml, et oleks võimalik viirustest kasvatada näidis, kusjuures algse protokolli RT-qPCR-l (Corman V. jt [8]) on juba umbes 4 koopiat proovi kohta partii (5 µl vastavalt ligikaudu 103 koopiat/ml) võib anda positiivse tulemuse, st 1000 korda varem kui tegelikult nakkava viiruskoormusega proovis. Kaubanduslikel PCR-testisüsteemidel, nn komplektidel, mõnikord on ka vähem kui 10 koopiat reaktsiooni kohta, näiteks TIB-Molbioli komplektid [9].

Siin tuleb teha tehnilist vahet kurgupiirkonna “koloniseerimisel” mõne viirusega, mis ei põhjusta nakkust, teiselt poolt tõelise “infektsiooni” vahel. Viimast seostatakse replikatsioonivõimeliste viirustega, mis seejärel viib a) sümptomaatilise haiguseni ja b) nakkavuseni, st võimeni nakatada teisi inimesi.

Drosten käsitles seda aspekti juba 2014. aastal ajakirjas Wirtschaftswoche antud intervjuus [10] seoses MERSiga:

„Jah, aga meetod (märkus: see tähendab PCR-i) on nii tundlik, et suudab tuvastada selle viiruse üksiku geneetilise molekuli. Kui selline haigustekitaja sibab näiteks päeva jooksul üle õe nina limaskesta (märkus: see oleks ülalmainitud “kolonisatsioon”), ilma et ta haigeks jääks või midagi muud märkaks, siis on tal ootamatult MERS. Kui varem teatati ravimatult haigetest inimestest, siis nüüd on aruandestatistikas järsku kaasatud kerged juhtumid ja inimesed, kes on tegelikult täiesti terved […] nakatunud“).

Arvan, et on küsitav, kas sümptomiteta või kergelt nakatunud haiglatöötajad on tõesti viirusekandjad. Veelgi küsitavam, kas nad suudavad viirust teistele edasi anda. Kuid just see viiruse leviku punkt (ja seega pandeemia liikumapanev jõud) on sekkumismeetmete, nagu karantiini-/isolatsioonikorraldused, “sulgumised“ ja nn AHA-reeglid, põhjuseks.

Täiendavad tõendid CT väärtuse asjakohasuse kohta

Jared Bullardi/Guillaume Poliquini uuringus Clinical Infectious Deseases 2020 [11], jõuti 2020. aasta mais järeldusele, et üle CT väärtuse 24-st ei leitud enam reprodutseeritavat viirust – see tähendab: katse kasvatada seejärel tampooniproovidest reprodutseeritavaid viirusi, mis andsid positiivse tulemuse ainult kõrgema CT väärtusega, ebaõnnestus.

Selle uuringu kohaselt on üle CT väärtuse 24 tuvastatava viiruse geneetilise materjali hulk nii väike, et positiivset testi ei saa enam tõlgendada aktiivse infektsioonina. Jaffari jt suur uuring [12] määras patsiendi proovimaterjalist SARS-CoV-2 kultiveerimise piiriks CT väärtuse 30.

Üksmeelne teaduslik arvamus (sealhulgas dr. Fauci USA CDC-st, aga ka mitmed teadlased, keda tsiteeris New York Times 2020. aasta augustis [13], tähendab, et kõigil “positiivsetel“ testi tulemustel, mis tuvastatakse alles pärast 35. tsüklit, pole teaduslikku (st tõenditel põhinevat) alust RT-qPCR SARS-CoV-2 tuvastamiseks, mida WHO abiga levitati kogu maailmas (ja kõik muud sellel põhinevad testid, määrati aga 45 tsüklile ilma CT väärtust määramata) “positiivseks“.

Samuti 2020. aasta mais avaldas Singapuri riiklik nakkushaiguste keskus seisukohavõtu [14], milles juhitakse tähelepanu:

Oluline on märkida, et viiruse RNA tuvastamine PCR abil ei võrdu nakkavuse või elujõulise viirusega.
PCR-i tsükli läviväärtus CT, mis on viiruse RNA sisalduse asendusmarker, tuvastab endiselt viiruse RNA CT-st 30, kuid ei tuvasta enam reprodutseeritavate viiruste olemasolu ja haiged inimesed ei ole nakkusohtlikud.

Originaaltsitaat:

„6. A surrogate marker of ‘viral load’ with PCR is the cycle threshold value (Ct). A low Ct value indicates a high viral RNA amount, and vice versa. As noted above, detection of viral RNA does not necessarily mean the presence of infectious or viable virus. In a local study from a multicenter cohort of 73 COVID-19 patients, when the Ct value was 30 or higher (i.e. when viral load is low), no viable virus (based on being able to culture the virus) has been found.“

„6. PCR-iga ‘viiruskoormuse’ asendusmarker on tsükli läviväärtus (Ct). Madal Ct väärtus näitab suurt viiruse RNA kogust ja vastupidi. Nagu eespool märgitud, ei tähenda viiruse RNA tuvastamine tingimata nakkusliku või elujõulise viiruse olemasolu. Kohalikus uuringus, mis hõlmas 73 COVID-19 patsiendist koosnevat mitmekeskuselist kohorti, kui Ct väärtus oli 30 või kõrgem (st kui viiruskoormus on madal), ei leitud elujõulist viirust (viiruse kultiveerimisvõime alusel).“

Samuti selgitab RKI oma kodulehel 11. augusti 2020 seisuga [15]:

„RKI diagnostika esialgsed tulemused näitavad, et kultiveeritavuse kadumisega rakukultuuris kaasnes RNA kogus <250 koopiat/5 µL RNA, mis määrati reaalajas PCR abil (märkus: see on RT qPCR). See RNA kontsentratsioon vastas kasutatud katsesüsteemis Ct väärtusele >30.“

Praegune Lõuna-Korea uuring [16] seab viiruskultuuri piiriks CT väärtuse 28,4.

Hiljutises Frankfurdis tehtud uuringus [17] näidati, et 64 RT-qPCR positiivsest patsiendiproovist (testitud üks geen) ainult 33 (= 52%) suutsid rakukultuuris viirusi kasvatada. Need nakkuslikud proovid muutusid positiivseks kuni keskmise CT väärtuseni 26 (täiendav joonis 1), samas kui viiruse kasv ei olnud enam võimalik kõrgema CT-ga proovidest.

Laboritevaheline testimine Instand e.V (Ringversuche Instand e.V) [18], vt ka järgmist punkti, näitab CT väärtuste tohutut vahemikku isegi kõrgelt standardiseeritud proovides erinevate laborite vahel ja ka erinevate sihtgeenide kohta. Näiteks sama määratletud SARS-CoV-2 lahjendatud proovi (proovi number 340061) CT WHO soovitatud geenide jaoks varieerub vahemikus 15-40 (E-geen), 20-40,7 (N-geen) ja 19,5-42,8 (RdRp geen). See näitab muljetavaldavalt katsestandardi äärmist puudumist osalevates (ja sertifitseeritud) laborites.

Selle taustal on kummaline, et RKI peab RT-qPCR-i endiselt „kuldstandardiks“ ilma täpseid valideerimisi ja väliseid sertifitseerimistingimusi määratlemata (ja ilma, et ametiasutused neid ilmselgelt täielikult jälgiksid).

Hindamine: üldiselt ei suuda RT-qPCR tuvastada terveid, elujõulisi (nakkuslikke) viiruseid, isegi mitte kogu tervet viiruse genoomi, vaid ainult otsitava lõigu nukleiinhapet. Hästi seatud ja õigesti sooritatud PCR-testide korral on üldiselt võimalik määratleda piirväärtus (CT) valideerimise teel paralleelse viiruse kasvatamisega rakukultuuris, millest suurem positiivne PCR-signaal ei korreleeru enam elujõuliste viirustega. See on veretoodete jälgimisel juba aastaid hästi praktiseeritud rutiin.

See range valideerimine võimaldab, seni, kuni testimissüsteemi EI muudeta, asendusmarkerina hinnata viiruskoormust ja seega testitud proovi võimalikku nakkavust, kuid mitte kunagi lõplikku tõendit. Niipea, kui mõnes kasutatud etapis muudetakse mõnda PCR-testisüsteemi komponenti (olgu selleks kemikaalid, plasttooted, ensüümid, protokolliprotsessid või masinad), tuleb süsteem uuesti kalibreerida. Kogu seni avaldatud teabe põhjal (vt eespool) võib eeldada, et CT väärtust üle 35 ei seostata enam nakkuslike viiruste kultiveerimise võimega ja seetõttu on otsuse absoluutne piir “positiivne“, olenemata testist kasutatav süsteem. Olenevalt testist võib CT vahemikku 25–35 siiski hinnata “positiivseks nakkavuse mõttes“, kui seda on vastavalt kirjeldusele võrreldud viiruskultuuriga läbiviidavas laboris piisava valideerimise kaudu.

CT≤ 25: positiivne

CT 26-35: positiivne ainult viiruskultuuriga sobitamisel

CT > 35: negatiivne

CT väärtuse ranget hindamist peetakse eriti oluliseks, kui sihtmärkide arv on üks, kuid üldiselt kehtib see iga üksiku sihtmärgi kohta.

Siiski üksi CT väärtus, ilma teabeta võrdluse kohta viiruse genoomide spetsiifilise arvuga (viiruskoormus) ja korrelatsiooniga võimega kultiveerida vastavaid viirusekoguseid, väärtusetu positiivse PCR-i tuvastamise hindamiskriteeriumina.

1.3.3. Piisav kontroll

Tundlikkuse ja spetsiifilisuse qPCR õigeks hindamiseks tuleb igasse reaktsioonitsüklisse lisada piisavad proovid. See algab katsekohas „tühjade tampoonidega“, et ohutult välistada saastumine proovivõtukohas, jätkub ekstraheerimise kontrollidega, et tagada reprodutseeritava RNA õige isoleerimine kõigi järgnevate töötlemisetappidega, st kunstlikult toodetud määratletud RNA-ga, mida kasutatakse: viiakse läbi ja töödeldakse kõikides tööetappides proovi ettevalmistamisest kuni PCR-i ning mille jaoks viiakse seejärel läbi PCR, kasutades sobivaid praimereid. See võib välistada võimaluse, et inhibeerivad ained või vead takistavad RNA amplifitseerimist proovi töötlemise ajal.

Lisaks peab iga õige testiseeria sisaldama väliseid negatiivseid kontrolle (st mida kantakse paralleelselt patsiendi proovidega) ja positiivset kontrolli, mis ideaaljuhul koosneb inaktiveeritud, määratletud SARS-CoV-2 viiruse tüvest. See oleks RKI enda ülesanne, teiste sobivate avalik-õiguslike institutsioonide, nagu Bernhard Nochti Instituut (Bernhard Nocht-Institut) või Friedrich-Löffleri Instituut (Friedrich-Löffler Institut), abiga, et toota seal olemasolevates laboriruumides piisaval hulgal SARS-CoV-2 viiruseid (ohutustase 4): eraldage patsientide proovid, kasvatage neist kontrollidena kindlaksmääratud tüvesid, inaktiveerige need ja andke need kindlaksmääratud viiruste arvuga üle testimislaboritele kontrollidena kohalike reguleerivate asutuste kaudu. Seda olulist teenust ei pakuta siiski ka pärast enam kui aastast “pandeemiat”, seepärast koosneb positiivne kontroll tavaliselt sünteetilisest RNA-st, mis kodeerib vaid testimissüsteemi sihtgeene. Selle positiivse kontrolli abil saab määrata ka PCR-i alumise avastamispiiri. Seda täpsustavad mõned kaubanduslikud komplektid, milles proovi kohta on 20 või vähem viiruse genoomi ja seega (vt punkt 1.3.2.) tuvastatakse juba proovis viiruse kogus, mis on 105 korda väiksem kui nakatav annus, mis tähendab: diagnostiline/prognostiline väärtus, millel on väärtus. [19]

Rõngastestid: korrektselt läbiviidud kontrollide hulka kuulub ka katselaborite osalemine nn ringkatsetes (vt ka 1.3.1.). Väline pakkuja pakub anonüümset testnäidiste paneeli. Viiruse tuvastamise korral sisaldavad need negatiivseid proove ja proove lähedalt seotud viirustega (inaktiveeritud), et kontrollida spetsiifilisust (need proovid ei tohi anda positiivset signaali) ja positiivseid proove otsitava viiruse erineva lahjendusega (inaktiveeritud), et määrata kindlaks tundlikkus (millisest viiruste arvust määratakse PCR-positiivne, millise CT väärtusega).

SARS-CoV-2 puhul viis ühendus „INSTAND eV” 2020. aasta aprillis läbi esimese ringtesti „Virusgenom-Nachweis – SARS-CoV-2 (340)“ („Viiruse genoomi tuvastamine – SARSCoV-2 (340)”. Aruande kohaselt võttis 488 laboratooriumi osa selles ringkatsest, millest 463 andis tulemusi. Tulemused leiate avaldatud kommentaarist: „Zeichhardt M: Commentary on extra ring test group 340 virus genoomi detection SARS-CoV-2” („Zeichhardt M: kommentaar täiendava ringtestirühma 340 viiruse genoomi tuvastamise kohta SARS-CoV-2“) [20], kus näidatakse kahte kõrvalekallet tavapärasest tasemetesti protseduurist, mis viitas juba laboriprobleemidele RT-qPCR-iga SARS-CoV-2 tuvastamiseks. Nii on kirjas väljaande lk 4: „Oluline teave hindamise kohta: 7 proovist, mida selles täiendavas ringkatses uuriti, võetakse eduka osalemise tunnistuse saamiseks arvesse.“ Kommentaari leheküljel 10 olev joonealune märkus ütleb:

„17. aprillil 2020 toimunud vahehindamise käigus anti kõigile 2020. aasta aprillis SARS-CoV-2 viiruse genoomi tuvastamise Täiendav INSTAND-ringi testis (340) osalejatele näidisomadused: näidised 340059, 340060 ja 340064 edastati enne tähtaega. Nende 3 proovi tulemusi ei võeta sertifikaadi väljastamisel arvesse […].“

Teatud proovide väljajätmise põhjus on selgitatud INSTAND eV aruande ülaosas kommentaari leheküljel 4:

„Sel ajal kui ekstra ringkatse veel käis, INSTAND eV sai nii kodu- kui välismaalt kiireloomulisi taotlusi uurida uuritavate proovide omadusi enne pikendatud esitamistähtaja lõppu, s.o enne 28. aprilli 2020, et laborid saaksid mis tahes valede mõõtmiste [osas] kiirelt oma katsemeetodeid täiustada“.

See protseduur on tegeliku laboritevahelise testi jaoks väga ebatavaline ja seetõttu ei kujuta see endast enam sõltumatut välist kontrollimisprotsessi kaasatud laborite jaoks.

Vaatamata juba avastatud proovidele ja vähenenud katsete ulatusele, esines paljudes laborites proovide segadust – nagu on kirjas kommentaari leheküljel 18:

„Proovi 340064 puhul (SARS-CoV-2 positiivne, lahjendatud 1:100 000) põhineb see vähenenud edukuse määr vaid 93,2%, peamiselt valede tulemuste määramise tõttu (segamine) proovide 340064 ja 340065 jaoks (negatiivne SARS-CoV-2 ja positiivne HCoV 229E suhtes). Segadused puudutavad proove 340064 ja 340065 24 laborit, kokku 59 tulemust proovi kohta. Vaata ka jaotist 2.4.2.1. […]”.

Seetõttu ajasid paljud laborid proovi 340064 (kergelt lahjendatud SARS-CoV-2) valesti segamini prooviga 340065 (negatiivne SARS-CoV-2 ja positiivne lähedalt seotud viiruse HCoV 229E suhtes).

Peale hirmutavat tõsiasja, et märkimisväärne hulk proove segati ilmselt ringkatses isegi väga standardiseeritud protseduuride korral (mis tõstatab küsimuse proovide segunemise ja seega massitestimise tingimustes valesti määratud tampooniproovide määrast), silmatorkav, et kõik teatatud segamised mõjutasid ainult neid kahte proovi, kuid mitte proove lõpliku numbriga 61 (väga tugevalt lahjendatud SARS-CoV-2) ja 62 (negatiivne), mida samuti hinnati. 2020. aasta juunis/juulis toimunud teise ring-robin testi üksikasjalikud tulemused [21] pole ikka veel avalikult saadaval.

1.3.4. Reaktiivide saastumise ja „probleemide kõrvaldamine tegevuse käigus“

Parim PCR-i ülesehitus võib siiski viia valepositiivsete tulemusteni, kui aluseks olevad reaktiivid/komplektid on saastunud positiivsete proovidega või kui tõenäolisem, et saastumine ilmneb labori töövoos. PCR on äärmiselt tundlik meetod (eksponentsiaalne reaktsiooni kulg), mis suudab tuvastada vaid mõne DNA molekuli, seepärast on PCR-i lõpptoodete laboratoorsed saastumised kliinilises diagnostikas suureks probleemiks, mida kirjeldasid näiteks 2004. aastal Aslanuadeh J. jt. [22]:

„A typical PCR generates as many as 109 copies of target sequence and if aerosolized, even the smallest aerosol will contain as many as 106 amplification products [6]. If uncontrolled, within a relatively short time the buildup of aerosolized amplification products will contaminate laboratory reagents, equipment, and ventilation systems [6]“.

„Tüüpiline PCR genereerib kuni 109 sihtjärjestuse koopiat ja kui aerosooliks muudetakse, sisaldab isegi väikseim aerosool nii palju kui 106 amplifikatsiooniprodukti [6] Kui seda ei kontrollita, saastab aerosoolitud amplifikatsiooniproduktide kogunemine suhteliselt lühikese aja jooksul laborireagendid, seadmed ja ventilatsioonisüsteemid [6]“.

Äärmuslik saastumise oht eeldab, et PCR-iga töötavatel diagnostikalaboritel kõrgeim tase testimisel on ettevaatlik – väga teadlikud töötajad, saastekindel keskkond, püsiv sõltumatu kontroll.

Juba ülalmainitud ringtestis 340 tekkis probleem valepositiivsete tulemustega, mida kommenteeriti järgmiselt (lk 20 allpool):

„Lisaks on mõnel juhul SARS-CoV-2 negatiivse kontrolli uuringu proovid 340060, 340062 ja 340065 näitavad spetsiifilisuse probleeme, mis ei sõltu proovide 340064 ja 340065 asendustest. Tuleb selgitada, kas need valepositiivsed tulemused on tingitud kasutatud testide spetsiifilisuse probleemist või SARS-CoV-2 levikust testi ajal või segaduses teiste selle ringkatse proovidega asjakohastes laborites“ (lehekülg 21 allpool [23]). Segaduse tuvastamiseks selles ringkatses vaadake üksikasju punktist 3.3. Lõigu lõpp.

Selle taustal, kui näete ka seda, kuidas näiteks BBC raporti kohaselt töötavad Inglismaa suured katselaborid avalikult ja on väga vastuvõtlikud koolitamata töötajatega saastumisele [24], pole see üllatav, kuigi Saksamaal (kus selliseid kaastöid pole veel filmitud) on aeg-ajalt teatatud „valepositiivsetest juhtumitest“, mis on tingitud meedias esinevast laboratoorsest saastumisest (ZB MVZ Augsburg: link jaotise lõpus). Isegi kontrollitud laboritingimustes ei saa sellise ülitundliku meetodi puhul täielikult välistada PCR-i tööetappidest põhjustatud saastumist. Valepositiivsete PCR-i tulemuste probleem põhjustab SARS-CoV-2 diagnostikat laboratoorsete protseduuride tõttu ja juba RT-qPCR esimeses väljaandes (Corman jt [25] tõi välja:

„Nelja üksiku katsereaktsiooni puhul oli nõrk esialgne reaktiivsus, kuid need olid sama analüüsiga uuesti testimisel negatiivsed […] tõenäoliselt probleemide lahendamiseks […]“.

Isegi kui protseduur laboris toimib optimaalselt ja seda väga jälgitakse, et laboriga seotud saastumist oluliselt minimeerida, võib tootja poolt kasutatud materjalide/kemikaalide saastumisel tekkida ootamatu valepositiivsete tulemuste allikas. Proovide võtmiseks kasutatud tampoonimaterjalid võivad olla saastunud juba tehases – näiteks „Heilbronni fantoomi“ puhul, kus kuriteopaigal DNA jälgede kogumiseks kasutatud vatitükid olid saastunud tootmisettevõtte töötaja jne pakendi DNA-ga. Aastaid takistati kohtuekspertiisi valejälgedega [26].

SARS-CoV-2 diagnostika puhul avaldati juba 2020. aasta juunis saasteprobleem, mis oli tingitud tehases lisatud positiivseid kontrolle sisaldavatest PCR-praimeritest (Wernike jt [27]). Siin oli märgata, et isegi mitme sõltumatu praimerite partiiga puhta vee proovid andsid RT-qPCR-is selgelt positiivse SARS-CoV-2 tuvastamise:

„However, there were also primers/probe sets that displayed very low‐level contaminations, which were detected only during thorough internal validation.“

„Samas oli ka väga madala saastetasemega praimereid/sondikomplekte, mis tuvastati alles põhjaliku sisemise valideerimise käigus.“

Mõned 2020. aasta suvel ajakirjanduses avaldatud SARS-CoV-2 RT-qPCR testimise valepositiivsed tulemused olid samuti seotud materiaalsete probleemidega [28].

Hindamine: isegi ideaalse RT-qPCR disaini ja hea laboritava koos piisava valideerimisega võivad igapäevased probleemid ja tehases saastunud proovidest põhjustatud välised probleemid oluliselt mõjutada RT-qPCR tulemuste kvaliteeti ja viia valepositiivsete tulemusteni.

1.3.5. Kaubanduslikud PCR-testikomplektid: diagnostika heakskiit?

Kaubanduslikke PCR-testisüsteeme, „PCR-komplekte“, kasutati rutiinsetes laborites väga varakult diagnostikaks, kuigi enamik neist oli deklareeritud ainult „RUO“ jaoks (ainult teadustööks). Eriti tähelepanuväärne on siin esimene ja seega silmapaistvaim testitootja, Berliini ettevõte TIB Molbiol, mille ettevõtte omanik (Olfert Landt) oli juba WHO protokolli soovitustes kirjas autorina Christian Drosteni kõrval. Neid komplekte, mis põhinevad WHO soovitustel, kasutab Roche oma suuremahulistes Cobas masinates ja seetõttu moodustavad need tõenäoliselt enamiku Saksamaal tavapäraseks diagnostikaks kasutatavatest komplektidest.

Täpseid numbreid ei saa kindlaks teha, kuid TIB Molbiol väidab, et 2020. aastal on kogu maailmas juba üle 60 miljoni testi [29], kuigi neid peetakse endiselt: „Not tested for use in diagnostic procedures“ („Ei testitud kasutamiseks diagnostikaprotseduurides” [30], mida on deklareeritud. Vastavad voldikud protokolli teabe ja komplekti kirjeldustega TIB Molbiolilt loodi üllatuslikult 15. jaanuaril 2020 (!!!) koos ROCHE SAP numbriga vastavalt algselt saadaolevate PDF-ide metainfole (saab esitada elektrooniliselt) ja on siiani muutumatul kujul saadaval (ehkki koos metaandmete analüüsiga 6. veebruaril 2020) paralleelselt teiste testikomplektidega, millel on nüüd in vitro diagnostika heakskiit.

1.4. RT-qPCR positiivse nukleiinhappe tuvastamise ja nakkavuse vaheline seos

Ainult need, kes on tegelikult nakatunud, võivad viirust edasi anda ja tekitada haigestumise ohtu ning seetõttu saab neid kasutada nakatumissageduse ja haiguslaine määramiseks:

„PCR tuvastamine on standardne test viirusnakkuste, nagu SARS-CoV-2, diagnoosimiseks. Test tuvastab üksikud patogeeni geenid, kuid mitte puutumata patogeenid. Ja: „Võimalus, et test on positiivne pärast nakkuse kestust, kuna ninas või kurgus on endiselt viirusejääke. Usaldusväärne nakkavuse tõendamine on võimalik ainult keeruliste testidega, mille käigus labor uurib, kas tampoonidest saadud materjal võib elusrakke tappa.“ Selle kirjutas Ärzteblatt 1. veebruaril 2021 [31].

„PCR-test tuvastab SARS-CoV-2 geenisegmente; ta ei ütle selle kohta midagi, kas need on nakkuslikud viirused või viirusejäägid pärast nende läbimist infektsioon. See nõuaks patogeeni kasvatamist.“ Frankfurdi terviseosakonna juhataja väljaanne augustist 2020 [32].

CDC väljaandes 13.07.2020 pealkirja all „Piirangud“ [33] leiate lk 38 rubriigist (mis on endiselt leitav lk 37):

„CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel For Emergency Use Only Instructions for Use“.

„• Detection of viral RNA may not indicate the presence of infectious virus or that 2019-nCoV is the causative agent for clinical symptoms.”

„CDC 2019-uudne koroonaviirus (2019-nCoV) reaalajas RT-PCR-i diagnostikapaneel ainult hädaolukorras kasutamiseks – kasutusjuhised“.

„• Viiruse RNA tuvastamine ei pruugi viidata nakkusliku viiruse olemasolule või sellele, et 2019-nCoV on kliiniliste sümptomite põhjustaja.“

Asjaolu, et SARS-CoV-2 puhas mRNA tuvastamine ei pea tingimata olema seotud haigusega ja seda ei saa kasutada haiguse hindamise ainsa kriteeriumina, vaid see on vaid vahend kliinilise diagnoosi kinnitamiseks, samuti selge. WHO teabes (avaldatud 20. jaanuaril 2021) [34]:

„Notice for IVD Users 2020/05, Nucleic acid testing (NAT) technologies that use polymerase chain reaction (PCR) for detection of SARS-CoV-2“.

„Teatis IVD kasutajatele 2020/05, Nukleiinhapete testimise (NAT) tehnoloogiad, mis kasutavad SARS-CoV-2 tuvastamiseks polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR)“.

„Notice for IVD Users 2020/05, Nucleic acid testing (NAT) technologies that use polymerase chain reaction (PCR) for detection of SARS-CoV-2“ („Teade IVD kasutajatele 2020/05, Nukleiinhapete testimise (NAT) tehnoloogiad, mis kasutavad SARS-CoV-2 tuvastamiseks polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR)” alates 13. jaanuarist 2021, kirjeldas:

„Where test results do not correspond with the clinical presentation, a new specimen should be taken and retested using the same or different NAT technology.”

„Kui testi tulemused ei ühti kliinilise pildiga, tuleks võtta uus proov ja seda uuesti testida sama või mõne muu NAT-tehnoloogiaga.“

Lisaks: „Most PCR assays are indicated as an aid for diagnosis, therefore, health care providers must consider any result in combination with timing of sampling, specimen type, assay specifics, clinical observations, patient history, confirmed status of any contacts, and epidemiological information”.

„Enamik PCR-analüüse on näidustatud diagnoosimise abistamiseks, seetõttu peavad tervishoiuteenuse osutajad arvestama mis tahes tulemusega koos proovide võtmise ajastuse, proovi tüübi, analüüsi eripära, kliiniliste vaatluste, patsiendi ajaloo, kontaktide kinnitatud olek ja epidemioloogiline teave“.

Lanceti väljaandes [35] kirjeldavad autorid RT-qPCR testi järgmiselt: „Meie arvates ei ole praegune PCR-test seetõttu sobiv kuldstandard SARS-CoV-2 rahvatervise testi hindamiseks“, sest nende arvates PCR on endiselt positiivne isegi siis, kui testitud ei ole enam positiivsed, kuna RNA püsib kehas nädalaid ja kuid isegi pärast seda, kui immuunsüsteem on sellega edukalt võidelnud, võib püsida ilma, et inimene oleks endiselt nakkav:

„Once SARS-CoV-2 replication has been controlled by the immune system, RNA levels detectable by PCR on respiratory secretions fall to very low levels when individuals are much less likely to infect others. The remaining RNA copies can take weeks, or occasionally months, to clear, during which time PCR remains positive”.

„Kui immuunsüsteem on SARS-CoV-2 replikatsiooni kontrollinud, langeb PCR-ga tuvastatav RNA tase hingamisteede sekretsioonidel väga madalale tasemele, kui inimestel on palju väiksem tõenäosus teisi nakatada. Ülejäänud RNA koopiate puhastamine võib kesta nädalaid või mõnikord kuid, mille jooksul PCR jääb positiivseks.“

1.5. Järeldus: RT-qPCR testide tähendus koroonaviiruse SARS-CoV-2 nakkuse tuvastamiseks

Arvestades punktis 1.3 kirjeldatud probleeme, ei ole RT-qPCR sobiv, usaldusväärne (ja heakskiidetud) diagnostikavahend nakkuslike (paljunevate) SARS-CoV-2 viiruste tuvastamiseks.
Peale selle on puhas RT-qPCR testi tulemus ainult laboriväärtus, punktis 1.4 esitatud teavet silmas pidades. Esitatud aspekti silmas pidades ei esitata ühtegi väidet nakkuslike viiruste esinemise kohta ja seda võib kasutada ainult koos kliiniliste sümptomite diagnoosiga (koguvad tervishoiuteenuse osutajad, Saksamaal arstid).

Kokkuvõte: kasutatav RT-qPCR ei sobi asümptomaatiliste inimeste testimiseks nina-neelu tampooniga, mida tehakse massiliselt kriitikavabalt ja valdavalt mittemeditsiinitöötajate poolt ILMA (siinkohal ülioluline: vastupidiselt WHO nõudele!) anamneesi ja nende sümptomiteta testitud SARS-CoV-2 nakkuse tuvastamiseks.

2. Antigeeni tuvastamine kiirtesti abil

2.1. Kiirtesti mõistete/aluste selgitused

Praegu SARS-CoV-2 diagnoosimiseks kasutatavad „kiirtestid“ põhinevad antigeenitesti põhimõttel, kasutades „külgvoolu“ (lateral flow) testimeetodit. See tuvastab viiruse valgukomponendi.

Antigeen on kolmemõõtmeline valkude ja muude orgaaniliste materjalide struktuur, mida antikehad (immunoglobuliinid) suudavad ära tunda ja siduda.

Viiruse antigeenide puhul on need tavaliselt viiruse struktuurist pärinevad üksikud valgukomponendid (valgud). Need võivad olla terviklikud struktuurvalgud, nagu pinnal olev „spike“ valk (S-valk, need on viiruse joonistel „varred nupud“) või ümbrisvalk („ümbrik“ – E-valk) või valk, millest pärit valk tuumaümbris moodustub (nukleokapsiid = N-valk). Isegi nende terviklike struktuurvalkude fragmentidest piisab sageli antikehadega seondumiseks. Need on niinimetatud epitoobid, mis esindavad ka tegelikku antikeha sidumissaiti puutumata struktuurvalgul. Igal struktuurvalgul on tavaliselt mitmesuguseid epitoope, nii et erinevad antikehad võivad samaaegselt seonduda sama valgu erinevate epitoopidega.

SARS-CoV-2 puhul on kõige olulisemad antigeenid (eelmainitud S-, E- ja N-valgud) need, mis viirusega nakatumisel käivitavad organismis immuunreaktsiooni. Selle tulemusena toodab organism antikehi, mis need antigeenid spetsiifiliselt ära tunnevad ja seejärel nendega seonduvad (antigeen-antikeha reaktsioon), et neutraliseerida viirused ja muuta need immuunrakkude poolt hävitatavaks. Seda antigeeni-antikeha reaktsiooni saab kasutada laboris antigeenide otsimiseks mis tahes proovist, kasutades sünteetiliselt toodetud antikehi.

Laboris tehtavate nn antigeenitestide (nende eesmärk on tuvastada antigeene antikehade abil, erinevalt nukleiinhappeid tuvastavast RTPCR-ist) põhiprintsiip, et in vitro toodetakse kaks sobivat antikeha, mis tunnevad ära otsitava antigeeni kaks erinevat epitoopi, nn “antikehapaar“. Mõlemad antikehad tuleb valida nii, et nad suudaksid tuvastada ja siduda ainult otsitaval antigeenil soovitud epitoobi, kuid mitte teisi sarnaste antigeenide struktuure. Seetõttu peavad need diagnostikas kasutamiseks olema väga spetsiifilised. Diagnostiliste antikehade kõrge spetsiifilisus tagatakse testi väljatöötamise käigus, kui võrrelda neid paljude väga sarnaste epitoopidega. Siin visatakse ära kõik soovimatuid epitoope seovad antikehad, kuni järele jääb vaid ideaalne antikehade paar, mis vastab nõuetele: väga kõrge spetsiifilisus, kõrged seondumisomadused (tundlikkus) ja puudub vastastikune mõju.

Antigeeni test ehitatakse seejärel sellele antikehapaarile, milles otsitav antigeen on seotud mõlema antikehaga samaaegselt ja asub nende vahel nagu kotlet võileivarullis (seega “võileiva test“) külgvoolu antigeeni kiirtestide jaoks, mida kasutatakse praegu elanikkonna lairiba-testides SARS-CoV-2 antigeenide tuvastamiseks.

Esimene kahest spetsiifilisest antikehast on nii seotud kandematerjaliga, et selle antigeeni sidumissait on vabalt ülespoole suunatud. See on kiirtesti hilisem piirkond, kus värvimuutus annab positiivse signaali. Teine antikeha on ühendatud tuvastamissüsteemiga, mis vastutab hiljem värvireaktsiooni eest, ja asub otse depoona kiirtesti selle punkti kõrval, kuhu proov langeb.

Testi protseduur: kui otsitav antigeen on nüüd tampooniproovis, siin on SARS-CoV-2 valk, kombineeritakse see pärast tuvastamiskasseti testväljale tilkamist depoos esimese spetsiifilise antikehaga. Antigeeni segu seotud esimese antikehaga ja liigsed seondumata antikehad migreeruvad nüüd kapillaarjõudude kaudu depoost katsevälja suunas. Siin seob seal fikseeritud teine spetsiifiline antikeha seejärel antigeeni esimese antikehaga, mis on sellega juba seotud. Lahus migreerub katseväljast väljapoole teise välja, kuhu on kinni jäänud liigsed antikehad (kontrollväli). Katse tuvastamise süsteem hakkab keemilise värvireaktsiooniga nähtavaks muutuma kõikjal, kus esimesed antikehad on seotud. Kontrollväljal põhjustasid selle üleliigsed antikehad, mis olid nüüd siia seotud ja mis tuvastussüsteemi endaga kaasa tõid, andes seega märku, et test toimis põhimõtteliselt probleemideta.

Testväljal on värvimuutus ainult siis, kui antigeen oli tegelikult proovis ja oli seotud teise seal fikseeritud antikehaga. Antigeen on testiväljale jõudnud juba esimese antikeha ja tuvastussüsteemiga, sellisel juhul algab siit ka keemiline värvusreaktsioon, mis viib testitavas piirkonnas värvimuutuseni (tavaliselt lilla triibuni). Kui soovitud antigeen oli tampooniproovis, võib see siduda esimese antikeha ja koos tuvastamissüsteemiga transportida selle fikseeritud teise antikeha juurde, mis seejärel selle antigeeni-antikeha tuvastamissüsteemi kompleksi kinni püüab ja seega selles positiivse signaali punkt.

Värvimuutus katseväljal (“positiivne“ signaal), mis kiirtestis nähtavaid triipe põhjustab, peetakse keemiliseks reaktsiooniks ja seetõttu võivad seda mõjutada reaktsioonitingimused, näiteks pH väärtus või prooviga kaasas olevad kemikaalid ja testivälja (test) selge usaldusväärsuse nõrk koht. See seletab paljusid internetis ringlevaid videoid, mis antigeeni kiirtestide abil tuvastavad SARS-CoV-2 õunamahlas, punases veinis, õlles jne.

2.2. Põhiteave antigeeni kiirtesti diagnostilise tähtsuse kohta

Sarnaselt RT-PCR-ga ei saa ka kiirantigeenitestid põhimõtteliselt tõestada, kas leitud viiruse antigeen kuulub puutumata nakkavasse viirusesse või on immuunsüsteemi poolt tapetud viiruste jääk (fragment).

Hoolimata sellest nakkavuse informatiivse väärtuse üldisest piirangust, kiirtestid on vaid soovituslikud ja neil puudub usaldusväärne diagnostiline tähtsus. Tuntuim kiirtest enne koroonaaegu oli raseduse kiirtest, mis töötab samal põhimõttel kui antikeha-antigeeni test. Rasedushormoon (HCG) toimib siin aga antigeenina. Kui uuritavas uriinis on seda piisav kogus, näitab test „positiivset“, antud juhul tõenäoliselt rase. Kuid kiirtestist üksi ei piisa, kuna arst kasutab diagnoosi tegemiseks HCG määramist veres ja ultraheli. SARS-CoV-2 komponentide tuvastamiseks mõeldud antigeenide kiirtestid võivad anda ainult viiteid võimalikule kolonisatsioonile või nakkavusele ja nende suhtes kehtivad sarnased piirangud nagu RT-qPCR.

2.3. Antigeeni kiirtestide usaldusväärsust mõjutavad tegurid

2.3.1. Eeltesti tõenäosus

RKI selgitab infograafikas rubriigis „Corona-Schnelltest-Ergebnisse verstehen“ („Covidi kiirtesti tulemusete mõistmine“), et eeltesti tõenäosuse aspekt kehtib nii antigeeni kiirtestide kui ka RT-qPCR testide kohta. [36]

RKI esitatud arvutusnäide antigeeni kiirtestide tõlgendamiseks eeldab realistlikku stsenaariumi, mis põhineb antigeenitestide tundlikkusel (tundlikkus) 80% ja spetsiifilisusel (usaldusväärsus) 98%, kusjuures ka siin [37] on sõnaselgelt mainitud: „Tuleb märkida, et erinevate kaubanduslikult saadavate testide jõudluses on olulisi erinevusi“ [38].

Kui 5 inimest 10 000 testitud inimesest on SARS-CoV-2-ga tegelikult nakatunud, jääb ikkagi 200 valepositiivset testi ja 4 tõeliselt positiivset testi. See tähendab, et 1 tõeliselt nakatunud inimene 10 000 inimese kohta jääks vahele, kuid 200 saaks valepositiivse tulemuse ja seetõttu peavad nad olema karantiinis/isolatsioonis, kuni RT-qPCR test annab “kõik selge“. Näiteks 1000 õpilasega koolitesti puhul tähendaks, et 20-le öeldaks vale: “Oled koroonapositiivne“ ja kool suletakse esialgu kuni järeltestimiseni “puhangukohana“. Selliseid juhtumeid on ajakirjanduses juba kajastatud.

Nürnbergi lähedal Altdorfis andis antigeeni kiirtestis positiivse tulemuse 180 keskkooliõpilasest 29, millest 28 osutus kontrollimisel negatiivseks (Merkur: [39])
Potsdamis andis 36-st õpetajast 12 antigeeni kiirtesti positiivse tulemuse ja nad saadeti karantiini. Pärast kontrollimist osutusid kõik testitulemused valepositiivseteks [40]
Medscape on isegi pealkiri: „200 valepositiivset, 8 avastati, 2 tähelepanuta jäetud – miks lastearstid ja noorukid on massiliste kiirtestide suhtes skeptilised [41]

Isegi kui tõeliselt nakatunud inimeste määr testitud inimeste rühmas oleks väga kõrge, nagu RKI teine arvutus näites (10 000-st testitud inimesest 1000), oleks kiirtestide tabamusmäär halb ja 180 inimesest saaksid valepositiivse teistitulemuse 200 testi kohta. Peamine mõju on siin testi halb tundlikkus.

RKI kodulehel olevas „Hinweisen zur Bewertung der Ergebnisse aus AG-Testen“ („Teabes AG-testide tulemuste hindamisest”) (märkus: antigeeni kiirtestid) on käsitletud valepositiivsete antigeenitestide probleemi:

„AG-testi kasutades positiivne testitulemus tekitab kahtluse ülekandega seotud SARS-CoV-2 infektsiooni [kohta] ja nõuab valepositiivsete tulemuste vältimiseks PCR-i uuesti testimist. Arvestades ebaõigete tulemuste potentsiaalselt olulisi tagajärgi on kõrged nõudmised mitte ainult antigeenitestide tundlikkusele, vaid ka spetsiifilisusele. Madala levimuse/testieelse tõenäosuse ja madala testispetsiifilisuse korral oleks oodata suurt valepositiivsete tulemuste arvu ja vastavat lisakoormust ÖGD-le meetmete kehtestamise ja vajaduse korral tühistamise tõttu.“ [42]

2.3.2. Tundlikkus (tundlik)

Antigeeni test ei tekita nii tugevat (eksponentsiaalset) väljundsignaali võimendust nagu RT-qPCR, vaid ainult piiratud signaali võimendust keemilise värvireaktsiooni kaudu, seepärast on seda tüüpi test oluliselt vähem tundlik kui RNA tuvastamine võrdluseks kasutatud RT-qPCR-ga. Antigeenide kiirtestide “alatulemus“ on Lanceti artikli teema [43], kuid siin see on antigeeni kiirtesti (siin nimetatakse LTF-iks, külgvoolutestiks) tulemus:

„[…] in all six observed cases, viral loads were very low (Ct ≥29 reflecting around <1000 RNA copies per mL in the laboratory used)—when LFT should be negative.”

„[…] kõigil kuuel täheldatud juhul oli viiruskoormus väga madal (Ct ≥29, peegeldades ligikaudu <1000 RNA koopiat ml kohta kasutatud laboris) – kui LFT peaks olema negatiivne“ (rõhuasetused lisatud).

Norra uuring .. [aprill 2021 (siin lisatud)] [44] kinnitab seda järeldust, et kiirtestide ebatäpsus on sümptomiteta inimestel ebarahuldavalt kõrge ja et ainult sümptomitega inimesi on võimalik tuvastada mis tahes täpsusega. Autorid järeldavad:

„Our results indicate that the test correctly identified most infectious individuals. Nevertheless, the sensitivity is considerably lower than for PCR“.

„Meie tulemused näitavad, et test tuvastab õigesti enamiku nakkusohtlikke inimesi. Sellegipoolest on tundlikkus oluliselt madalam kui PCR-i puhul“.

See oletatav tundlikkuse puudumine on kõige levinum kriitikapunkt, kui esitatakse teateid antigeeni kiirtestide ebausaldusväärsuse kohta. Pharmazeutische Zeitung [45] kirjutab, et „antigeeni kiirteste saab enamasti kasutada väga suure viiruskoormusega nakkusohtlikel inimestel“. Keppler selgitab: „Siiski ei saa kiirtesti negatiivse tulemusega infektsiooni usaldusväärselt välistada.“ Siin on aga aluseks antigeeni kiirtesti võrdlemine RT-qPCR-ga, et ainult osa RT-st ehk -qPCR tampooniproovid on positiivsed, mis muutuvad positiivseks ka antigeeni kiirtestis.

RKI epidemioloogiabülletään 3/2021 kajastab kiirtestidega uuringut Stuttgardi kliinikus (alates lk 11: [46]). Tabel 1 näitab, et 18 asümptomaatilisest inimesest, kelle SARS-CoV-2 RNA test oli RT-qPCR abil positiivne, oli antigeeni kiirtestis positiivne signaal ja 42-st sümptomaatilisest inimesest 36-l, „kuna antigeenitesti tundlikkus on asümptomaatilistel inimestel väga piiratud, ei saa selle kollektiivi individuaalne testimine piisavalt välistada SARS-CoV-2 nakatumist. Madala Ct väärtusega (st kõrge viiruskoormusega) väga nakkavad inimesed tuvastatakse piisava kindlusega.“ Andmed näitavad: „Alates Ct väärtusest 22 või vähem, oli antigeenitesti avastamismäär 100%.“ See näide näitab väga selgelt, et usaldusväärne antigeeni test, kui see on õigesti tehtud, korreleerub väga hästi sümptomitega inimestel, kellel on RT-qPCR kiire reaktsioon (madal CT väärtus), asümptomaatilised inimesed ja ainult RT-qPCR positiivsed inimesed, kellel on kõrge CT väärtus. See räägib antigeeni kiirtestide tõelisest tähtsusest kõrge viiruskoormuse tuvastamisel sümptomitega inimestel. Kuid nende andmete kohaselt ei sobi test sümptomiteta inimeste testimiseks nii nakatuda võivate inimeste usaldusväärseks tuvastamiseks kui ka tervete inimeste usaldusväärseks negatiivseks tuvastamiseks. Selline leid saavutati ka praeguses Frankfurdi uuringus [47], kus kasutati kolme antigeeni kiirtesti (seal AG-RDT, Antigen-Rapid diagnostic test) võrreldi rakukultuuris samadest proovidest võetud viiruskultuuriga ja korreleerus RT-qPCR-ga. Autorid kirjutavad abstraktselt:

„In contrast, three Ag-RDTs demonstrated a more significant correlation with cell culture infectivity (61.8–82.4%).”

„Seevastu kolm Ag-RDT-d näitasid olulisemat korrelatsiooni rakukultuuri nakkavusega (61,8–82,4%).“

See tähendab, et nendest proovidest, mis olid antigeenitestis positiivsed, saadi positiivset tulemust ka viiruse kultiveerimisel oluliselt kõrgema tabamussagedusega kui oluliselt tundlikumate RT-qPCR “positiivsete” puhul reprodutseeritava viiruse vahelisele suurele kokkuleppele sümptomaatiliste patsientide proovis [48]. Siin võrreldi kaubanduslikku kiirantigeenitesti viiruse kultiveerimisega rakukultuuris ja RT-qPCR-ga.

See näitab antigeenitesti kõrget tabamust (positiivset tulemust) ainult siis, kui proovid sisaldasid ka reprodutseeritavat viirust. Siin sai viirusi kasvatada 85-st 147 proovist (=58%), mis olid positiivsed antigeeni kiirtestis ja RT-PCR-is (siin CT-ga umbes 22), kuid ainult 11-st 124 proovist (= 9%), kes olid RT-qPCR positiivsed (siin CT 33-34), kuid antigeeni kiirtest oli negatiivne.

Üldiselt võib nendest avaldatud andmetest märkida järgmist:

Proovid, millest saab rakukultuuris kasvatada viiruseid, st millel on suur (nakkuslik) viiruskoormus, tuvastatakse hea täpsusega 162 antigeeni kiirtesti ja madala CT-ga (alla 25) RT-PCR abil.
Proovid, millest ei saa rakukultuuris viirusi kasvatada: on hinnatud ja õigesti rakendatud antigeeni kiirtestides tavaliselt negatiivsed (peale valepositiivsed – vt 2.3.3) ja neil on kõrged CT väärtused RT-qPCR-is (tavaliselt üle 33). Need proovid pärinevad valdavalt asümptomaatiliselt testitud inimestelt ja tõestavad, et neil juhuslikel ilma kliiniliste sümptomiteta “positiivsetel“ ei ole nakkuslikku viiruskoormust.

2.3.3. Usaldusväärsus (spetsiifilisus): valepositiivsete tulemuste välistamine

Paljud kasutatavad antigeeni kiirtestid ei ole veel läbinud regulaarset CE-märgise vastavushindamismenetlust ja on saanud BFArMi eriloa vastavalt meditsiiniseadmete seaduse paragrahvile 11 [49]. Neid teste viivad laialdaselt läbi ka väljaõppeta mittemeditsiinitöötajad või isegi “enesetestidena“.

Antigeeni kiirtestide läbiviimise küsimuses räägib professor dr. Oliver Keppler, Müncheni Ludwig Maximiliansi ülikooli Max Pettenkoferi instituudi viroloogia juht 13. jaanuaril 2021 väljaandes Pharmazeutische Zeitung ilmunud artiklis [50]:

„[…] need testid tuleb samuti õigesti läbi viia. See peaks olema koolitatud spetsialistide kätes. „Nüüd on tekkinud mõte värvata vanade- ja hooldekodudesse selliseid teste läbi viima suur hulk tööotsijaid. Kui kasutatakse koolitamata töötajaid, olen mures, et testitulemuste usaldusväärsus kannatab veelgi.““

Praegune Cochrani ülevaateartikkel „Aktualisierter Cochrane Review bewertet Zuverlässigkeit von Schnelltests zum Nachweis von COVID-19“ („Värskendatud Cochrane’i ülevaade hindab kiirtestide usaldusväärsust COVID-19 tuvastamiseks“) [51] jõuab ka sama järelduseni, et antigeeni kiirtestid on sümptomitega inimestele oluliselt usaldusväärsemad kui sümptomiteta testitud inimestele. Kuid isegi sümptomitega inimestel on selles uuringus hinnatud parimate kiirtestide usaldusväärsus märkimisväärselt piiratud, seega kirjeldavad autorid järgmisi stsenaariume:

1000 sümptomitega inimesest koosnevas populatsioonis, kellest 50 inimesel on tegelikult COVID-19, testivad need kiirtestid eeldatavasti õigesti umbes 40 inimest, tuvastades kui COVID-19 nakatunud ja 6–12 COVID-19 juhtumit jääb vahele. 5–9 positiivsetest testitulemustest osutuvad ülevaatamisel valepositiivseteks.
10 000-st ilma sümptomiteta inimesest koosnevas rühmas, kus 50 inimest on tegelikult nakatunud SARS-CoV-2-sse, tuvastatakse 24–35 inimest õigesti viirusekandjatena ja 15–26 juhtu jäetakse vahele. Võib eeldada, et testid annavad 125–213 positiivset tulemust ja 90–189 neist positiivsetest tulemustest on tegelikult valepositiivsed.

Katse spetsiifilisuse puudumisest tingitud valepositiivsete tulemuste tagajärgede kohta vt 2.3.1. „Eeltesti tõenäosus“.

2.5. Järeldus:

Masstestimiseks kasutatavad antigeeni kiirtestid ei anna teavet nakkavuse kohta, kuna need suudavad tuvastada ainult valgukomponente, mis ei ole seotud terve reprodutseeritava viirusega.

Testitud inimeste nakkavuse hindamise võimaldamiseks tuleks läbiviidud positiivset testi (sarnaselt RT-qPCR-ga) võrrelda individuaalselt võimega kasvatada uuritavast proovist viirusi, mis on äärmiselt varieeruva olukorra korral võimatu, ja kontrollimatud katsetingimused.
Testide madal spetsiifilisus põhjustab palju valepositiivseid tulemusi, millel on tarbetud isiklikud (karantiin) ja sotsiaalsed tagajärjed (nt koolide sulgemine, haiguspuhangu teated), kuni need osutuvad valehäireteks.

Täpsema teabe saamiseks viidatakse asjaosaliste kirjalikele esildistele.

Kirjandus

[1] Nt Primer Blast https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

[2] https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus-assay – v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf

[3] https://www.who.int/docs/default – source/coronaviruse/protocol-v2-1 . pdf?sfvrsn=a9ef618c_2

[4] https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/331329/ WHO-COVID-19-laboratoorium – 2020.4-est.pdf?sequence=1&isAllowed=y

[5] Saadaval ainult Interneti vahemälus: https://www.oder-spree-piraten.de/wp – content/uploads/2020/05/Ge%C3%A4ndertes-Befundlayout-der-SARS-CoV2-PCR – Tulemused – _-Labor-Augsburg-MVZ-GmbH.pdf

[6] https://corona – gemeinschaft.de/wp-content/uploads/2020/07/Instand-Ringprüfung-Virusgenom-Nachweis – SARS-CoV-2.pdf

[7] Joonis 1e, Wölfel et al., https://doi.org/10.1038/s41586-020-2196-x

[8] https://www.eurosurveillance.org/content/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

[9].https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_53-0777_96_Wuhan-R – gene_V200204_09155376001%20%282%29.pdf

[10] https://www.wiwo.de/technologie/forschung/virologe-drosten-im-gespraech-2014-die-who – kann-nur-ommenden-ausfragen/ 9903228-2.html

[11] https://doi.org/10.1093/cid/ciaa638

[12] https://academic.oup.com/cid/article/72/11/e921/5912603

[13] https://www.nytimes.com/2020/08/29/health/coronavirus- testing .html

[14] https://www.ncid.sg/Documents/Period%20of%20Infectivity%20Position%20Statementv2.pdf

[15].https://www.rki.de/DE/Content/InfAZ/N/Neuhaftes_Coronavirus/Vorl_Testung_nCoV.html#doc13490982bodyText4

[16] https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMc2027040

[17] https://www.mdpi.com/2077-0383/10/2/328

[18] https://www.finddx.org/covid-19/ (algne link ei avanenud 16.10.2024)

[19] Ülevaate praegu kasutatavatest kaubanduslikest komplektidest koos nende konveieriandmetega leiate aadressilt http://www.finddx.org/covid-19/pipeline/?section=molecular-assays#diag_tab (link ei avane 16.10.2024)

[20] https://corona-ausschuss.de/wp-content/uploads/2020/07/Instand-Ringversuch-Virusgenom-Nachweis-SARS-CoV-2.pdf

[21] https://www.instand-ev.de/System/rv – files/Zusammenfassung%20der%20Sampleproperties%20and%20Setpoints%20Virology%20340%20Juni %20July%202020% 2020200911a.pdf (link pole saadaval 16.10.2024)

[22] http://www.annclinlabsci.org/content/34/4/389.full.pdf+html

[23] https://www.instand-ev.de/System/rv-files/340%20DE%20SARS – CoV-2%20Genom%20April%202020%2020200502j.pdf

[24] https://www.youtube.com/watch?v= Uk1VK1RENtE

[25] https://www.eurosurveillance.org/ content/10.2807/ 1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

[26] https://www.faz.net/aktuell/gesellschaft/kriminalitaet/dna-ermittlungspanne-das-phantom-von-heilbronn-ist-widerlegt-1925411.html

[27] https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tbed.13684

[28] https://www.br.de/nachrichten/bayern/probleme-in-augsburger-labor-bringen-falsche-testergebnisse,SEh5Qq4

[29] https://www.tib-molbiol.de/de/covid-19

[30] https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_53-0777_96_Wuhan-R-gene_V200111_09155376001.pdf

[31] https://www.aerzteblatt.de/nachrichten/120745